Esclerosis Múltiple: MOSPD2 es un blanco terapéutico para el tratamiento de inflamación en SNC

MOSPD2 es un blanco terapéutico para el tratamiento de inflamación en SNC

Yacov, N.; Kafri, P.; Salem, Y.; et al

MOSPD2 is a therapeutic target for the treatment of CNS inflammation
Clinical and Experimental Immunology. 2020, 0:1-16
doi: 10.1111/cei.13448
Open Access

Resumen

En esclerosis múltiple (EM) y encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), las células mieloides conforman la mayor parte del infiltrado inflamatorio en SNC. Co-mo describimos previamente, el dominio móvil de la proteínas espermática 2 (MOSPD2), se expresa en células mieloides humanas y regula in-vitro la migración de monocitos. El rol de MOSPD2 en la patogénesis de EAE se estudió generando knock-out (KO) de MOSPD2 en ratones y anticuerpos monoclonales dirigidos con-tra ella. Encontramos que el desarrollo de EAE en ratones con MOSPD2 KO esta-ba significativamente suprimido, el rango de monocitos inflamatorios en sangre también estaba significativamente reducido en esos ratones. Además, las células T de ratones MOSPD2 KO mostraron secreción reducida de citoquinas proinflamato-rias y aumento en la producción de interleuquina 4 (IL 4). El uso profiláctico o como tratamiento de anticuerpos monoclonales (mAbs) contra MOSPD2 limitan el desa-rrollo y reducen la severidad de EAE. Esos resultados sugieren que MOSPD2 es clave en la regulación de la migración de monocitos inflamatorios y los mAbs anti-MOSPD2 constituyen una terapia potencial de enfermedades inflamatorias del SNC.

Introducción

La EM se caracteriza por daño neurológico resultante de desmielinización provo-cada por respuesta autoinmune a la mielina. En la EAE un modelo bien estudiado de EM, la patogénesis implica la infiltración de linfocitos T helper tipo 1 (Th1) y Th17 en SNC, seguida de reclutamiento de monocitos plasmáticos. La movilidad de esos leucocitos depende de la interacción entre receptores de citoquinas y sus ligandos relacionados. Los monocitos son esenciales para el desarrollo y progre-sión de la EAE. Más aun, estudios recientes sugieren que la infiltración monocitaria es responsable de la desmielinización inicial, aunque también incluye reclutamiento de células T patogénicas, presentación de antígenos (Ags) y stress oxidativo y me-diadores inflamatorios. Monocitos circulantes que migran al SNC se identificaron como CD11b+Ly6Chi, haciendo que un subconjunto de receptores de citoquinas (CCR2 +) dentro de monocitos Ly6Chi sea esencial para la progresión de la enfer-medad. Sin embargo, no hay drogas disponibles dirigidas a las citoquinas o sus receptores que atenúen la infiltración de monocitos circulantes en el SNC de pa-cientes con EM. La MOSPD2 es una proteína de superficie expresada en monoci-tos humanos; esa proteína regula la migración de monocitos independientemente de su activación por ligando. Dado el papel de monocitos circulantes en EAE, ex-ploramos el efecto de MOSPD2 en la patogénesis de la enfermedad usando rato-nes KO y anticuerpos bloqueantes. La caracterización del sistema inmune de los ratones MOSPD2 KO reveló un desarrollo normal del tejido linfoide, donde la canti-dad de leucocitos y la frecuencia de subconjuntos fue comparable a la de los rato-nes de tipo salvaje (WT). Las células T activadas de ratones KO proliferaron nor-malmente, mientras que el perfil de citoquinas indicó una reducción proinflamatoria y propensión a la diferenciación de Th2. El perfil de frecuencia en periferia, mostró que el porcentaje de monocitos inflamatorios CD11b + Ly6Chi se redujo a la mitad. Un examen adicional demostró que la liberación de monocitos desde la médula ósea (BM) a circulación se atenuó en ratones MOSPD2 KO; y un porcentaje menor de monocitos periféricos presenta un estado estable durante la homeostasis en estos ratones. Tras inmunización con péptido de glucoproteína de oligodendrocitos de mielina pMOG35-55, se suprimió el desarrollo y la progresión de EAE en rato-nes MOSPD2 KO; un examen patológico reveló que la infiltración de monocitos y células T en el SNC se redujo notablemente. Además, los mAbs generados contra MOSPD2 suprimieron profundamente el desarrollo de EAE. En conjunto, el estudio indica que la MOSDP2 es esencial en la patogénesis de EAE y que atacar MOSPD2 usando mAbs es un prometedor tratamiento de la EM a través de un me-canismo que interfiere con la acumulación de monocitos en SNC.

Material y métodos

Ratones

Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 de 8-10 semanas de edad en Envigo (Rihovot, Israel). Los ratones transgénicos del receptor de células T (TCR) C57BL / 6-Tg (Tcra2D2, Tcrb2D2) 1Kuch/J (2D2) y B6.Cg-Tg (TcraTcrb) 425Cbn/J (OT-II) que reconocen respectivamente al péptido glucoproteico de oligodendrocitos de mielina (pMOG35-55) y ovoalbúmina (pOVA323-339). El estado de salud de los animales se verificó al ingreso de los mismos.

Solo animales saludables se aclimataron al laboratorio. Los mismos fueron aloja-dos dentro de una instalación libre de patógenos específicos para roedores de ac-ceso limitado (SPF). Al monitorear la debilidad en extremidades posteriores, se co-locó comida húmeda dentro de las jaulas para permitir el acceso a comida y agua. Al final del estudio, los animales fueron sacrificados por inhalación de CO2.

Generación de ratones MOSPD2 KO

Se generaron ratones MOSPD2 KO. La estructura de direccionamiento MOSPD2 se introdujo en células madre embrionarias en un fondo C57BL por recombinación homóloga. Dos genes que pertenecen a la misma familia, MOSPD1 y MOSPD3, parecían estar implicados en el desarrollo. El cassette de selección de neomicina introducido en el vector de direccionamiento es una unidad de transcripción inde-pendiente impulsada por un promotor fuerte (fosfogliceratoquinasa: pGK) que pue-de interferir con el promotor endógeno MOSPD2. Después de la transferencia Southern, los clones de células ES recombinadas y validadas se transfectaron con un plásmido que expresa Flp-recombinasa para eliminar el neocasette y generar los clones de células ES recombinadas; estos clones se inyectaron luego en blas-tocistos de ratones albinos C57BL, dando como resultado un quimerismo del color del pelaje. Para generar ratones heterocigotos con alelo KO, los machos altamente quiméricos (> 50% de tasa de quimerismo del color del pelaje) derivados de los clones de células ES neo-extirpadas mediadas por Flp se aparearon con hembras C57BL/6 Cre. los animales KO heterocigotos constitutivos MOSPD2 se cruzaron para generar la línea de ratón KO homocigoto. Para la validación de transferencia Southern de ratones KO homocigóticos, la digestión del inhibidor de proteasa ge-nómica de Allium sativum (ASPI) se probó con una sonda de 5 ‘.
Para el genotipado, se realizó reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Reactivos

Toxina Pertussis (PT), péptidos correspondientes a residuos 35–55 de MOG de rata (MEVGWYRSPFSR VVHLYRNGK) y residuos 323–339 (ISQAVHAAHAEI NEAGR) de OVA. Fluoresceína anti CD4 de ratón, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina de CD4 (PE), cianina CD8a-PE- y C7, gamma interferón PE, interleuquina 17 (IL17)-Flúor Alexa, interferón (IFN)-γ-PE, interleuquina (IL)-17-Alexa 647, CD25-PE, CD16/32, caja proteína tenedor 3-peridinina (FoxP3)-peridinina, clorofil (Per6CCP)-Cy5.5, CD3, CD28, anti-Ki-67-PE, antígeno anti-linfocito 6C (Ly6C) Alexa-Flúor 488, anti-Ly6G-aloficocianina (APC), anti-CD11b-PE, anti-CD115-APC y anti-B220-APC.
Aislamiento de subconjuntos de células inmunes de ratón y humanas
Monocitos de ratón y células T se aislaron del bazo utilizando microesferas CD11b y CD90.2, respectivamente. Se obtuvieron muestras de sangre venosa de donan-tes macho sanos. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en Ficoll-Paque Plus. Utilizando tubos de 50 ml, las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) incubándose a 4°C durante 15 minutos en tampón que contenía PBS y albúmina bovina al 0,5% (BSA) con microperlas CD14 humanas.

Estimulación de células T y análisis de citoquinas

Para la estimulación libre de APC, se sembraron células T (2 x106/ml) en placas de fondo plano y se activaron con anti-CD3 y anti-CD28. Luego se recogieron las célu-las, se centrifugaron para la recolección de sobrenadante y se analizaron por cito-metría de flujo. Los sobrenadantes se analizaron mediante un ensayo inmunoab-sorbente ligado a enzimas (ELISA) para la secreción de IL-17A, IFN-γ, IL-10 e IL-4. Para la proliferación in-vitro pOVA323–339 dependiente de antígeno, las células T CD4+ OT-II (5×105) se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), cultivadas en placas en presencia de monocitos esplénicos CD11b (5×105) y pOVA323–339 durante 3 días. Luego se recogieron las células, se centri-fugaron, se tiñeron para CD4 y se analizaron por citometría de flujo. Los sobrena-dantes se recogieron y analizaron usando el ensayo multiplex de citoqui-na/quimiocina de ratón Milliplex MAP. Para la estimulación ex-vivo, los ratones se inmunizaron vía sbc en dos sitios en el costado, con inóculos de 100 μl por sitio de pMOG35-55 (1,5 mg/ml) emulsionados en adyuvante completo de Freund (CFA) (2,5 mg/ml). Siete a 10 días después, se extirparon células de ganglios linfáticos, se preparó una suspensión de células individuales y se sembraron a una concen-tración de 4×106/ml en presencia de 30 μg/ml de pMOG35-55 ó 2 μg/ml de anti-CD3 durante 3 días. Los sobrenadantes se recogieron y analizaron mediante kits ELISA.

Western blots

Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de lisis que contenía ditio-treitol 1:100, fosfatasa e inhibidores de proteasa. Las muestras se cargaron en un gel Criterion TGX prefabricado. Se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon con leche al 5% o BSA en solución salina tam-ponada con Tris y Tween 20 (TBST) durante 1 h, seguido de incubación con anti-cuerpo monoclonal (mAb) MOSPD2 anti-humano de ratón desarrollado interna-mente (1:1000) y anticuerpo secundario anti-ratón de cabra peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:3000). Luego se agregó proteína de choque térmico (HSP) 90 (1:1000)

Migración celular in-vitro

Para analizar quimiotaxis, RANTES (CCL5, 100 ng/ ml), MCP-1 (CCL2, 100 ng/ml) o SDF-1 (CXCL12 , 25 ng/ml); se disolvieron en 0,5% de FBS/RPMI-1640 y se co-locaron en la cámara de un ensayo de migración QCM. Se sembraron células (3×105) en la cámara superior, seguido de incubación durante 3 h, después de lo cual se determinó el número de células que migraron al compartimento inferior mediante un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS).

Tinción por IF

La tinción se realizó en secciones de 4 μm (tres duplicados) de diferentes segmen-tos de médula espinal (torácica, lumbar y sacra). Para tinción con CD3 y antígeno macrófago 2 (Mac-2), la recuperación de antígeno se realizó en ácido cítrico 10 mM pH6 durante 10 minutos, usando un programa de bajo punto de ebullición para desenmascarar antígenos. Después de la incubación previa con suero de caballo normal al 20% y Triton X-100 al 0,2%, los portaobjetos se incubaron con los anti-cuerpos primarios a temperatura ambiente (RT) durante 24 h, seguido de incuba-ción a 4ºC durante 48 h. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-CD3 para células T y anti-MAC-2 para macrófagos activados. El segundo paso del anticuerpo implicó el marcado con anticuerpos conjugados Cy2 altamente absorbidos o Cy3 durante 30-60 min. Las secciones teñidas se examinaron y fotografiaron utilizando un microscopio de fluorescencia conectados a una cámara monocromática. El nú-mero de células infiltrantes por ratón se determinó contando las células en el dupli-cado del infiltrado más poblado de cada sección espinal y luego calculando el nú-mero promedio de células infiltrantes para las tres secciones. El área contada del infiltrado fue de 0,16 mm2
Para la tinción de proteína básica de mielina (MBP), la recuperación del antígeno se realizó durante 10 minutos en microondas para desenmascarar antígenos y epí-topes. Las secciones se preincubaron con suero de caballo al 20% y Triton X-1000 al 0,2% durante 1 h, seguido de incubación con anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 28 h. Para potenciar la señal, se añadió un anticuerpo secunda-rio, anti-rata biotinilada durante 90 minutos, seguido de Cy2 durante 1 hora. La in-tensidad de fluorescencia, medida en secciones tomadas de ratones de control sa-nos, se determinó como un área de cobertura de 100% de MBP. La intensidad de fluorescencia se midió para los seis segmentos de médula espinal de los ratones. Se calculó la intensidad promedio de las secciones más afectadas de cada seg-mento. Se calculó el porcentaje del área total de cobertura de MBP.

Inducción de EAE

Para inmunización activa, se inyectan ratones en dos sitios por vía sbc con 100 μl de inóculo/sitio de pMOG35–55 (1,5 mg/ml) emulsionado en CFA (2,5 mg/ml). PT (500 ng/500μl PBS) se inyectó intraperitonealmente (ip) inmediatamente y 48 h después de la inmunización. Para la transferencia adoptiva, se inmunizaron rato-nes 2D2 como se describió sin PT. Una semana después, se extirparon bazo y ganglios linfáticos para preparar la suspensión celular, que se activó con pMOG35-55 (20 μg/ml) durante 3 días en presencia de IL-12 recombinante de ratón (10ng/ml). Se recogieron las células, se lavaron y se inyectaron ip (10–15×106/ratón) en receptores vírgenes irradiados (400 rad).
La gravedad de EAE se evaluó de la siguiente manera: 0 = normal, 1 = cola flácida, 2 = debilidad de las extremidades posteriores, 3 = parálisis de patas traseras, 4 = parálisis de las patas traseras y delanteras, 5 = agonía o muerte.

Transplante de médula ósea

Los ratones receptores se irradiaron (1000 rad) usando acelerador lineal. Al día siguiente, las células de médula ósea (5×106) aisladas de fémur y tibia del donante se administraron por vía intravenosa (iv); 3 semanas después se indujo a los rato-nes receptores para EAE.

Depleción de monocitos circulantes

Para depletar monocitos circulantes, los ratones fueron inyectados con 200 μl de clodronato liposomal. Se monitorearon niveles de CD115+ para evaluar la deple-ción y recuperación de monocitos periféricos.

Generación de anticuerpos monoclonales anti MOSPD2

Se generaron mAbs anti-MOSPD2 humanos de ratón. La síntesis génica se realizó para incluir una región extracelular etiquetada con His × 6 (aminoácidos 1-496) de MOSPD2 humano. El inserto se subclonó y el vector de expresión se transfectó en células de ovario de hámster. La proteína se purificó en resina de níquel y un sis-tema de purificación de proteínas AKTA. El producto final se evaluó mediante elec-troforesis en gel de dodecilsulfato de poliacrilamida de sodio (SDS-PAGE) y trans-ferencia Western. Los ratones fueron inyectados con la región extracelular de MOSPD2 humano. Se fusionaron los bazos con línea celular de mieloma de ratón Sp2/0. Los sobrenadantes de suero e hibridoma se seleccionaron por ELISA contra el Ag inmunizante y la citometría de flujo contra células transfectadas con una construcción de proteína fluorescente verde (GFP)-MOSPD2 etiquetada con His. Los anticuerpos para experimentos in-vivo se produjeron en condiciones de cultivo celular sin suero ni animal.

Mapeo de epítopes lineales de mAbs anti-MOSPD2

El mapeo de epítopes lineales de mAbs anti-MOSPD2 se realizó contra la región extracelular de MOSPD2 humano y se tradujo en péptidos lineales de 15 aminoá-cidos, con una superposición péptido-péptido de 14 AAs. Los microensayos de péptidos MOSPD2 humanos se incubaron con mAb anti-MOSPD2 a una concen-tración de 1 μg/ml seguido de tinción con anticuerpo IgG Fc DyLight680 anti-ratón de cabra secundario y fueron leídos usando un sistema de imágenes Odyssey de LI-COR.

Prevención y tratamiento de EAE con mAb anti-MOSPD2

Para experimentos de prevención; 500 μg de mAbs anti-MOSPD2 o controles pa-reados con isotipo (inmunoglobulina de ratón (Ig) G1), clon MOPC-21 e IgG2a de ratón; el clon C1.18.4 se inyectó ip un día antes de inducir la enfermedad y cinco veces más, una cada 3 días, un total de seis veces. Para el régimen de tratamien-to; cuando la enfermedad alcanzó un puntaje promedio de 2, los ratones fueron asignados a dos grupos: uno recibió 500 μg de mAb anti-MOSPD2 y otro un anti-cuerpo de control con isotipo coincidente; cada dos días, un total de siete veces.

Estadísticas

Los análisis estadísticos se realizaron con SigmaPlot versión 14.0. La significación estadística de las diferencias entre los grupos se determinó mediante la prueba t de Student a dos colas, o mediante análisis de varianza (ANOVA) con prueba de comparaciones múltiples. Todos los datos se expresaron como media ± error es-tándar (SE) o como se indique. La significación estadística fue un valor p< 0,05.

Aprobaciones del ensayo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, del Centro Médico Sheba; Ramat Gan, Israel. Se obtuvieron muestras de sangre venosa de donantes varones sanos en cumplimiento con la Junta de Revisión Institucional en el Centro Médico Sheba, Ramat Gan, Israel. Se recibió el consentimiento informado por escrito de participantes antes de la obten-ción de muestras.

Resultados

Generación de MOSPD2 KO de ratón

Para evaluar el efecto de MOPSD2 en el desarrollo de la inflamación, generamos ratones con deleción de los exones 4-5 en el gen MOSPD2, utilizando el constructo de orientación. Los ratones KO constitutivo se identificaron mediante PCR y se ve-rificaron adicionalmente mediante análisis de transferencia Southern. La ablación de la proteína se verificó mediante transferencias Western realizadas en células aisladas de bazo, BM y timo.

Tejidos linfoides y sus poblaciones celulares en ratones MOSPD2 KO perma-necen intactos
Se evaluó el efecto de deficiencia de MOSPD2 en el desarrollo de tejidos linfoides y subconjuntos celulares. El número total de células de bazo fue el mismo para los ratones WT y MOSPD2 KO, y las proporciones de células B esplénicas y de gan-glios linfáticos, monocitos, células T CD4; así como células T reguladoras, también fueron comparables). Además, el número total de timocitos y proporciones de célu-las tímicas SP CD4 y SP CD8 fueron similares en ratones con deficiencia de WT y MOSPD2 .

Ratones MOSPD2 KO muestran una proporción reducida de monocitos inflamato-rios periféricos

Encontramos que en ratones MOSPD2 KO el recuento total de glóbulos blancos (WBC) se redujo en comparación con ratones WT. Además, las proporciones de células mieloides CD11b+ Ly6C y monocitos inflamatorios CD11b+ Ly6Chi, así como de neutrófilos CD11b+ Ly6G disminuyeron significativamente en esos rato-nes. Un subconjunto de células dentro de los monocitos CD11b+ Ly6Chi, que ex-presan receptor de quimiocinas CCR2, es crucial para el avance de la inflamación. El análisis de ese subconjunto mostró que entre los monocitos CD11b + Ly6Chi, las células CCR2+ se redujeron significativamente en ratones MOSPD2 KO. Sin embargo, al analizar la frecuencia de la población de linfocitos en la periféricos se revelaron proporciones similares de células B y aumento moderado de los linfocitos T en ratones MOSPD2 KO. A medida que el conjunto de monocitos inflamatorios circulantes se mantiene por liberación de BM; se examinó el número de células to-tales y el porcentaje de CD11b+ Ly6Chi en el BM. El número total de células y la relación CD11b+ Ly6Chi en el BM fue similar para ratones MOSPD2 KO y WT. Es-tos resultados indican que el MOSPD2 puede regular la motilidad de monocitos y neutrófilos desde el BM a circulación. El CD115 es un receptor de macrófagos-CSF (M-CSF), y es usado comúnmente como marcador monocitos circulantes. La in-yección iv de clodronato liposomal resulta en eliminación rápida de todas las célu-las periféricas CD115+, seguido de su aparición gradual. Eliminamos monocitos sanguíneos en ratones WT y MOSPD2 KO y luego rastreamos su regreso a la peri-feria. Durante el estado estacionario, las células CD115+ periféricas de ratones MOSPD2 KO se redujeron significativamente en comparación con ratones WT. Veinticuatro horas después de la administración de clodronato, los monocitos peri-féricos fueron eliminados de sangre en ratones KO y WT. Tres días después, se detectó un aumento notable de monocitos periféricos WT, pero solo se observó una pequeña reposición en ratones KO. En mayor tiempo se alcanzó un nivel de monocitos periféricos estable en la periferia tanto para ratones WT como para MOSPD2 KO, pero la diferencia en la proporción de monocitos sanguíneos persis-tió en todo momento. Estos datos sugieren que la liberación de monocitos de BM a la periferia, en lugar de su diferenciación de HSC, se ve afectada en ratones defi-cientes en MOSPD2.

La deficiencia de MOSPD2 no afecta la función efectora de células mieloides

Para responder si la ausencia de MOSPD2 afecta las funciones mieloides efecto-ras, se aislaron células CD11b de bazos de ratones WT y MOSPD2 KO. Después de 72 h de incubación con células T transgénicas CD4+ TCR marcadas con CFSE específicas para péptido de ovoalbúmina pOVA323-339 y el antígeno; se analiza-ron para determinar la dilución de CFSE. La dilución CFSE de células T CD4 espe-cíficas de pOVA323, fue similar cuando se activó con APC de ratones WT y MOSPD2 KO; lo que indica que MOSPD2 no es esencial para presentación de an-tígenos que activan T. El análisis de los sobrenadantes no mostró diferencias signi-ficativas en la secreción de citoquinas, aunque se observó una propensión hacia un fenotipo Th2 con menor producción de citoquinas Th1 y Th17. Un desafío ex-vivo de ganglios explantados de ratones inmunizados con pOVA323–339 demostró tasas comparables de proliferación de células T. Además, ni la fagocitosis por neu-trófilos ni la producción de citoquinas a partir de células mieloides esplénicas en respuesta al sacárido (LPS) no se vio perturbada por la deficiencia de MOSPD2.

La inducción de EAE se suprime en ratones MOSPD2 KO

Células T y monocitos están involucrados en la patogénesis de EM y su modelo animal la EAE. Los resultados muestran que ratones MOSPD2 KO estaban prote-gidos contra desarrollo de EAE. Las infiltraciones de células inmunes en el SNC, junto con la desmielinización, son las características principales de la EAE. En consecuencia, probamos si la deficiencia de MOSPD2 impide la infiltración de célu-las inmunes en SNC. Las secciones de médula espinal se tiñeron por inmunofluo-rescencia con anti-Mac-2 y CD3 para indicar la presencia de macrófagos y células T activadas, y se analizaron en busca de MBP para evaluar la integridad de la mie-lina. La infiltración de monocitos periféricos y células T se vio gravemente afectada en ratones MOSPD2 KO y la proporción de regiones desmielinizadas estuvo muy reducida menor en médulas espinales tomadas de ratones MOSPD2 KO. El aisla-miento de células mononucleares de SNC de ratones WT y MOSPD2 KO después de inducir EAE, demostró infiltración reducida de monocitos inflamatorios en SNC. Para evaluar la importancia de la expresión de MOSPD2 en células hematopoyéti-cas sensibles a radiación y compartimentos resistentes a la misma en la patogéne-sis de EAE, ratones MOSPD2 KO y WT se irradiaron con una dosis letal y poste-riormente se trasplantaron con BM de ratones WT o KO. El curso y la gravedad de la enfermedad fueron similares para los ratones receptores KO y WT reconstituidos con BM de ratones WT pero cuando la expresión de MOSPD2 estaba ausente en células hematopoyéticas, la progresión de la enfermedad se suprimió en compara-ción con los ratones que recibieron células BM de donantes WT. Estos datos indi-can que la presencia de MOSPD2 en células no hematopoyéticas es prescindible y su expresión en células hematopoyéticas, probablemente células mieloides; es ne-cesaria para la progresión de la enfermedad. Para proporcionar evidencia de apo-yo de un papel para MOSPD2 de monocitos en la patogénesis de la enfermedad; las células T 2D2 se transfirieron adoptivamente a ratones receptores WT y KO. En la primera fase; cuando la enfermedad está mediada por células T, la gravedad fue comparable entre los grupos de ratones. Sin embargo, en etapas posteriores, cuando los monocitos están implicados, los síntomas clínicos persistieron y em-peoraron en los ratones WT, mientras que los ratones KO exhibieron una disminu-ción en la gravedad.

Células T de ratones MOSPD2 KO son propensas a fenotipo semejante a Th2

El MOSPD2 se expresa en células mieloides en ratones y humanos; no se pudo detectar en células T en reposo o activadas. Para probar si el efecto sobre la pato-génesis de EAE en ratones MOSPD2 KO implica atenuación indirecta de la función del efector de células T; los ratones WT y MOSPD2 KO se inmunizaron con pMOG35-55 y se midió la secreción de citoquinas proinflamatorias después del desafío ex-vivo. Los resultados demuestran que la inmunización de ratones MOSPD2 KO genera células T pMOG35-55 con secreción atenuada de citoquinas proinflamatorias, IFN-γ e IL-17. Esta observación no fue específica de antígeno, ya que la estimulación policlonal con anti-CD3 mostró diferencias similares en la se-creción de citoquinas entre células T de ratones WT y KO.
El análisis de los sobrenadantes recogidos 48 y 72 h después de la activación mo-stró que la secreción de IL-4 en células T purificadas de ratones MOSPD2 KO au-mentó más del doble, mientras que IL-17 e IFN-γ disminuyeron en ~ 40%. La defi-ciencia de MOSPD2 no obstaculizó la producción de la citoquina antiinflamatoria IL-10.

La liberación de monocitos de BM en MOSPD2 KO mejora en EAE

En EAE, la frecuencia de monocitos inflamatorios periféricos CD11b+ Ly6Chi au-menta durante las fases preclínica y pico. Después de su menor salida de BM en ratones MOSPD2 KO, se monitorearon cambios en monocitos inflamatorios circu-lantes durante la enfermedad pico y en la eutanasia. A pesar que la EAE se supri-mió en ratones MOSPD2 KO durante toda la experiencia; el patrón de alteración de frecuencias en monocitos CD11b+ Ly6Chi totales e inflamatorios fue similar para ratones WT y KO, pero permaneció más bajo en los últimos.

Generación y selección de mAbs de plomo anti-MOSPD2

Reconociendo el potencial de MOSPD2 como un objetivo terapéutico en EM y po-siblemente en enfermedades inflamatorias afectadas por monocitos adicionales, nos propusimos desarrollar mAbs anti-MOSPD2 que mostrarían un efecto benefi-cioso sobre la patogénesis de EAE. Los mAbs de ratón se generaron inmunizando ratones con la porción extracelular de MOSPD2 humano. Para respaldar la selec-ción del anticuerpo principal, todos los mAbs se probaron mediante citometría de flujo para determinar la unión a la membrana plasmática que expresa MOSPD2 humana de longitud completa y posteriormente se examinó su efecto sobre la mi-gración de monocitos humanos in-vitro. Dos de los clones probados, 1 y 3, inhibie-ron profundamente la migración de monocitos humanos pero no de células T. Los anticuerpos pueden unirse a su antígeno a diferentes tasas de afinidad, con valo-res de constante de disociación de equilibrio (KD) que van desde 10−6 M para an-ticuerpos de baja afinidad hasta 10−12 para anticuerpos de muy alta afinidad. Para evaluar la fuerza de unión de los clones 1 y 3 al MOSPD2 humano, se realizaron pruebas de afinidad utilizando Biacore. Los resultados muestran que los valores de KD para ambos Acs estaban en el rango más bajo (10−10–10–10 M), lo que indica una fuerte interacción anticuerpo/ antígeno. Entre los dos; el clon 3 fue el agluti-nante preferido de MOSPD2, con un valor de KD menor que el clon 1. Para deli-near los epítopes en MOSPD2 humano reconocido por los dos clones de ratón que mostraron actividad biológica, una micromatriz que contiene péptidos de 15 ami-noácidos con una superposición de 14 aminoácidos, demostró que los clones 1 y 3 muestran una respuesta contra un solo epítope similar. De acuerdo con su KD, el clon 3 también exhibió respuesta más fuerte al epítope identificado que al clon 1. La MOSPD2 es una proteína conservada, con una identidad de secuencia del 90% entre humanos y ratones. Además, las regiones de unión de los clones 1 y 3 son idénticas en MOSPD2 humano y de ratón. Por consiguiente, anticipamos que los clones 1 y 3 reaccionarían de forma cruzada con MOSPD2 de ratón. Las transfe-rencias de Western y el análisis FACS, confirmaron la unión de ambos clones a MOSPD2 de ratón. Cuando los clones 1 y 3 de mAb anti-MOSPD2 se emplearon en células mieloides aisladas de bazo de ratón, inhibieron profundamente su mi-gración.

Los mAbs anti-MOSPD2 muestran un efecto terapéutico contra EAE

El papel esencial demostrado para MOSPD2 en el desarrollo de EAE utilizando ratones KO sugiere que los mAb clones 1 y 3 pueden tener efecto terapéutico en EAE. Para probar esto, se administraron anticuerpos en un régimen profiláctico, comenzando 1 día antes de la inmunización de ratones WT para inducción de EAE con inyecciones de anticuerpos posteriores cada dos días. Encontramos que los clones 1 y 3 inhibieron significativamente el desarrollo de la enfermedad. Similar a la patología observada para ratones MOSPD2 KO inmunizados para inducción de EAE; la administración de anticuerpos anti-MOSPD2 redujo el número de células T infiltrantes, monocitos y restringió el daño a mielina. Luego se investigó si atacar MOSPD2 con mAbs en etapas avanzadas de la enfermedad puede mejorar la EAE. Con ese fin, EAE se administró por primera vez a ratones WT, y cuando la gravedad clínica media alcanzó un score de 2 los ratones se dividieron en dos gru-pos y se trataron con control del isotipo o clon 3 de mAb anti-MOSPD2. Los resul-tados mostraron que el blanco MOSPD2 en el pico de la enfermedad con mAbs específicos, redujo significativamente la gravedad de la misma.

Discusión

Tanto en la EM como en su modelo animal EAE, linfocitos y monocitos están impli-cados en el inicio y la progresión de la enfermedad. Sin embargo, mientras que al-gunos medicamentos actuales contra EM están diseñados para atenuar la reacción inmune adaptativa; ninguno se dirige directamente a los monocitos/ macrófagos. Hasta hace poco, no se podía hacer una distinción funcional entre microglia y mo-nocitos circulantes con respecto a su contribución a la patogénesis de EAE. Yama-saki y col. demostraron que los macrófagos derivados monocitos provenientes de circulación están involucrados en desmielinización, mientras que la microglía tie-nen más probabilidades de eliminar desechos. Estos datos sugieren que bloquear la migración de monocitos circulantes al SNC de pacientes con EM podría tener potencial terapéutico.
La MOSPD2, es una proteína que ha demostrado regular la migración de monoci-tos humanos inducida por quimiocinas, independientemente del ligando activador; es un blanco potencial para el tratamiento de EM.
Llevamos a cabo dos enfoques diferentes. El primero fue generar ratones con defi-ciencia de MOSPD2, que permitió el estudio de las manifestaciones clínicas, la his-topatología y el mecanismo; y en el segundo se incluyó el uso de mAbs contra MOSPD2. A diferencia del timo, los ganglios linfáticos y el bazo, que se desarrolla-ron normalmente en ratones KO y presentaron frecuencias comparables de sub-conjuntos de células inmunes a los ratones WT, el perfil extraído de la periferia demostró una disminución en la frecuencia de los monocitos inflamatorios CD11b + Ly6C +. A diferencia de los resultados observados en ratones KO; en los experi-mentos de quimera BM, la fase de inducción en EAE mediada por células T no se vio afectada cuando los HSC de ratones KO se injertaron en receptores KO o WT. El profundo efecto que tuvo la deficiencia de MOSPD2 sobre la patogénesis de EAE provocó el desarrollo de mAbs con posibilidad de perturbar la infiltración de monocitos en SNC. En consecuencia, desarrollamos una serie de mAbs contra MOSPD2 humano y probamos su efecto sobre la migración de monocitos. Entre estos mAbs, dos clones tuvieron un impacto significativo en la quimiotaxis de mo-nocitos. Los resultados sugieren fuertemente que los anticuerpos anti-MOSPD2 tienen el potencial de tratar enfermedades inflamatorias del SNC, como EM.